染色体17p13.3肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离
作者：郭鸣雷 赵新泰 万大方 顾健人
单位：郭鸣雷 赵新泰 万大方 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室 上海 200032)
关键词：杂合性缺失；外显子捕获
肿瘤000421 摘要：目的 在染色体17p13.3杂合性缺失区域内进行表达序列的分离。方法 采用外显子搏获法对位于17p13.3杂合性缺失区域内的BAC基因组克隆进行外显子的分离。结果 在获得的克隆中，4个克隆为已知基因的外显子，另4个克隆属于3个新外显子(2个克隆中的外显子片段序列一致)。结论 在染色体17p13.3杂合性缺失区域内获得了一些表达序列。
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0290-03
ISOLATION OF EXONS ON THE LOSS OF HETEROZYGOSITY REGION OF CHROMOSOME 17p13.3 IN TUMORS BY EXON TRAPPING
, http://www.100md.com
GUO Ming-lei
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
ZHAO Xin-tai
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
WAN Da-fang,et al.
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective Isolation of expression sequence on the Loss of Heterozygosity (LOH) region on chromosome 17p13.3 was caried out.Methods Exon trapping.Results Eight exons were isolated ,4 of them are exons of known genes and the others are novel.Conclusion Some exons on the LOH region of chromosome 17p13.3 were obtained.
Key words： Loss of heterozygosity (LOH)； Exon Trapping
17号染色体与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系，著名的p53基因定位于17p13.3区域。近来越来越多的文献报道17p13.3区域在多种肿瘤中发生高频率的杂合性丢失(Loss of Heterozygosity LOH)，如在成神经管细胞瘤，星形胶质细胞瘤，原发性外胚层肿瘤，乳腺癌，卵巢癌，肾细胞瘤和肝癌[1]。提示此区域内可能含有一个或多个抑癌基因。本实验室研究已证明了肝癌中染色体17p13.3区域内存在高频率的LOH，确定了其共同缺失的最小范围，并获得了位于该范围的基因组克隆。在这些工作基础上，开展该区域内的外显子分离工作。希望以此作为第一步，能够发现与肝癌发生与发展相关的基因。
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材料和方法
1.材料
Eqon Trapping试剂盒购自GIBCOL BRL公司。限制性核酸内切酶PstⅠ，NotⅠ等，牛小肠碱性磷酸酶，T4DNA连接酶，DH10B菌，氨苄青霉素购自Promega公司。TRⅠzol抽提液，DEPC溶液购自Sigma公司。COS-7细胞购自中科院细胞所；Lipofect ACE试剂，无血清的Opti-MEM培养液，DMEM培养液购自GIBCOL BRL公司。PCR反应试剂盒购自华美公司。
2.方法
a.BAC基因组DNA的制备
具体过程参见《分子克隆》中大量抽取质粒DNA的方法。所得DNA用水溶解后定量，NotⅠ酶切鉴定。脉冲场凝胶电泳确定BAC片段的大小。
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b.外显子捕获法
可分为重组子的制备：重组子DNA转染COS-7细胞；COS-7细胞总RNA的抽提；逆转录酶多聚酶链反应(RT-PCR)；PCR产物的亚克隆及测序几部分。具体操作步骤参见《分子克隆》中各章节和外显子捕获法的说明书。
c.序列测定结果的计算机分析
将序列与相应的BAC基因组序列数据库进行比较，确定有无匹配，从而证明此序列确实来源于基因组。用本实验室开放阅读框架寻找工具查找基因序列可能的编码框架。
结果
1.NotⅠ酶切BAC基因组DNA的脉冲场凝胶电泳
为了确定BAC克隆外源片段的大小，首先用Not Ⅰ内切酶酶解BAC407、BAC1840和BAC414克隆。经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定是否酶切完全。如图。可见Not Ⅰ酶解后，载体片段(7.1 Kb)完全释放出来，说明酶解完全。酶解样品再经冲场电泳分离确定每个BAC的大小。从图2可见，BAC407的外源片段约为50 Kb;BAC414的外源片段约为90 Kb；BAC1840的外源片段的为110 Kb。
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图1 琼脂糖凝胶电泳
(M:Marker,1:BAC407,2:BAC414,3:BAC1840)
图2 脉冲场凝胶电泳
(M:Marker,1:BAC407,2:BAC414,3:BAC1840)
2.Pst Ⅰ酶切BAC DNA的琼脂糖凝胶电泳
本实验的第一步为选择合适的限制性内切酶酶切BAC DNA。因为BAC DNA的酶解片段要与载体PSPL3相连接。为了保证连接效率，酶解片段不能太大；同时酶解片段也不应太小，从而使其可能包含的外显子的机率降低。所以合适的范围为2～6 Kb。实验中选择了载体多克隆位点上不同限制性内切酶PstⅠ，Eco RⅠ和BamHⅠ分别进行酶切。经过比较，PstⅠ内切酶的酶解片段较符合要求(如图3)，因此用它进行以下的实验。
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图3 Pst Ⅰ酶切BAC DNA的琼脂糖凝胶电泳
(M:Marker;1:BAC5G11;2:BAC222J22 3:BAC34P24;4:BAC586L11;5:BAC12506)
3.Pst Ⅰ酶切重组子克隆的琼脂糖凝胶电泳
BAC DNA酶解片段与载体连接，转化。为了验证连接效率，必须对重组子进行鉴定。挑取克隆，小量抽提后，用Pst Ⅰ内切酶酶切后电泳，观察有无外源片段的释放。如图4所示，每个克隆均有外源片段。
图4 重组子克隆Pst Ⅰ酶切后的琼脂糖凝胶电泳
4.总RNA的甲醛凝胶电泳
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将抽提的混合重组子DNA转染COS-7细胞，培养一定时间后，进行总RNA的抽提。如图5所示，表明RNA质量完好，没有降解。
图5 总RNA的甲醛凝胶电泳
1：BAC5G11；2：BAC222J22；3：BAC347P24；4：BAC586L11；5：BAC12506；6：control
5.逆转录多聚酶链反应后产物的鉴定
将总RNA先进行逆转录，再用试剂盒中特定的引物进行第一轮和第二轮PCR，走琼脂糖凝胶电泳，观察有无条带产生。如图6所示，表明可能有外显子片段。
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图6 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
5G11-1的序列：
GAGGCTCAGA GGATGCCACC GAGTGGACGG ACGTGAGCAG GACCACAGAG ACAACCCAGT
GGGACACGCA ACACTGTTCC CAAGATGTTA GCAGGGGAAA GAGTCGGACG AAATGGCGAA
GTGTTTGGCA CAAAGAAGAC CAACAAATGA CACACCAAGC CAGTAAAGAC ACCTCCAC
6.候选阳性外显子克隆的测序结果
将含有外显子片段的克隆培养，抽提质粒DNA，定量后用377型自动测序仪测序。本文列出5G11-1的序列的序列。其它序列不再赘述。
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7.候选阳性外显子克隆序列的计算机分析结果
将所得序列与计算机里的序列数据库进行比较
附表 外显子克隆序列的计算机分析结果 BAC克隆
外显
子数
外显子性质
BAC407I21：
4
肌球蛋白外显子；磷脂酰肌醇激酶外显子，新基因外显子，空载体
BAC5G11：
3
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新基因外显子，载体来源，空载体
BAC347P24：
2
新基因外显子，载体来源
BAC222J22：
2
Tau基因外显子，载体来源
BAC12506：
2
OVCA1基因外子，载体来源
BAC586L11：
1
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载体来源
3 讨论
外显子捕获法(Exon Trapping)的原理是根据前体mRNA在转录后发生内含子剪切而设计[2]。把一段基因组序列克隆入合适的载体中。该载体含有发生剪切序列所必须的剪切信号。若这段基因组序列含有完整的外显子，在转录后就能发生剪切。该方法已被多家实验室采用，已生产出专用的试剂盒，使用较为方便。文献报道，此方法的灵敏度为20～80 kb范围内可以捕获一个外显子[4]。本实验总共获取8个外显子片段，而原始BAC克隆覆盖的杂合性缺失范围约为450 kb，因此灵敏度与报道相符。获取的8个外显子片段(代表7个外显子)中有6个与17p数据库有高度匹配，说明它们确实来自缺失区域内。而BAC222J22的Tau基因的外显子片段经证实不在17p内。原因可能是此BAC克隆为嵌合克隆，其基因组片段由两部分组成。
从结果可看出，有相当一部分为同一载体为源的假阳性外显子(在挑选克隆测序的过程中，已经剔除了大部分认为可能是同一外显子的克隆，其根据是它们的PCR产物电泳时处于同一位置。当然PCR产物处于同一位置的克隆其外显子也有可能不一样，对此，作者也挑选进行测序。然而结果是全部来源于载体的同一序列)。由此推测，在整个转化所得的克隆中，载体来源的假阳性外显子比例将达70 %～80 %。假阳性率太高，不能令人满意。经仔细研究了载体的序列后，发现在HIV-TAT的内含子中，多克隆位点的右侧，有一隐蔽剪切位点(包括受体和供体)，长度约为110bp，它可以发生类似外源外显子的剪切，逃避BstXⅠ的降解作用，强烈地干扰正常的捕获过程，使假阳性率大大提高[4]。另外有一些克隆测不出序列，显示为混合克隆。原因可能是挑取培养的过程中，操作失误，导致克隆的相互污染，然而检查其PCR产物却只有一条带，说明污染的可能性不大；也可能此克隆在扩增的过程中发生突变，导致序列的不一致。空载体产生的原因则是BstⅪ酶切处理不完全。
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作者简介：郭鸣雷，男，硕士，实习研究员。
参考文献
[1]Saxena A,Clark WC,Stark M,et al.Evidence for the involvement of a potential second tumor suppressors on chromosome 17 distinct from p53 in malignant astrocytomas〔J〕.Cancer Res,1992,52:6716
[2]卢大儒,邱信芳,薛京伦.医学分子遗传学〔M〕.上海：复旦大学出版社，1997：69
[3]Church DM,Stoler CJ,Jones D,et al.Isolation of genes from complex sources of mammalian genomic DNA using exon amplification〔J〕.Nature Genet,1994:98:6
[4]Burn TC,Connors TD,Berd AP,et al.Increased exon-trapping efficiency through modifications to the PSPL3 splicing vector〔J〕.Gene,1995,161:183
(收稿日期：1999-10-14；修回日期：2000-01-17), 百拇医药
单位：郭鸣雷 赵新泰 万大方 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室 上海 200032)
关键词：杂合性缺失；外显子捕获
肿瘤000421 摘要：目的 在染色体17p13.3杂合性缺失区域内进行表达序列的分离。方法 采用外显子搏获法对位于17p13.3杂合性缺失区域内的BAC基因组克隆进行外显子的分离。结果 在获得的克隆中，4个克隆为已知基因的外显子，另4个克隆属于3个新外显子(2个克隆中的外显子片段序列一致)。结论 在染色体17p13.3杂合性缺失区域内获得了一些表达序列。
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0290-03
ISOLATION OF EXONS ON THE LOSS OF HETEROZYGOSITY REGION OF CHROMOSOME 17p13.3 IN TUMORS BY EXON TRAPPING
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GUO Ming-lei
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
ZHAO Xin-tai
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
WAN Da-fang,et al.
(Shanghai Cancer Institute,The National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai 200032.P.R.China)
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Abstract：Objective Isolation of expression sequence on the Loss of Heterozygosity (LOH) region on chromosome 17p13.3 was caried out.Methods Exon trapping.Results Eight exons were isolated ,4 of them are exons of known genes and the others are novel.Conclusion Some exons on the LOH region of chromosome 17p13.3 were obtained.
Key words： Loss of heterozygosity (LOH)； Exon Trapping
17号染色体与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系，著名的p53基因定位于17p13.3区域。近来越来越多的文献报道17p13.3区域在多种肿瘤中发生高频率的杂合性丢失(Loss of Heterozygosity LOH)，如在成神经管细胞瘤，星形胶质细胞瘤，原发性外胚层肿瘤，乳腺癌，卵巢癌，肾细胞瘤和肝癌[1]。提示此区域内可能含有一个或多个抑癌基因。本实验室研究已证明了肝癌中染色体17p13.3区域内存在高频率的LOH，确定了其共同缺失的最小范围，并获得了位于该范围的基因组克隆。在这些工作基础上，开展该区域内的外显子分离工作。希望以此作为第一步，能够发现与肝癌发生与发展相关的基因。
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材料和方法
1.材料
Eqon Trapping试剂盒购自GIBCOL BRL公司。限制性核酸内切酶PstⅠ，NotⅠ等，牛小肠碱性磷酸酶，T4DNA连接酶，DH10B菌，氨苄青霉素购自Promega公司。TRⅠzol抽提液，DEPC溶液购自Sigma公司。COS-7细胞购自中科院细胞所；Lipofect ACE试剂，无血清的Opti-MEM培养液，DMEM培养液购自GIBCOL BRL公司。PCR反应试剂盒购自华美公司。
2.方法
a.BAC基因组DNA的制备
具体过程参见《分子克隆》中大量抽取质粒DNA的方法。所得DNA用水溶解后定量，NotⅠ酶切鉴定。脉冲场凝胶电泳确定BAC片段的大小。
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b.外显子捕获法
可分为重组子的制备：重组子DNA转染COS-7细胞；COS-7细胞总RNA的抽提；逆转录酶多聚酶链反应(RT-PCR)；PCR产物的亚克隆及测序几部分。具体操作步骤参见《分子克隆》中各章节和外显子捕获法的说明书。
c.序列测定结果的计算机分析
将序列与相应的BAC基因组序列数据库进行比较，确定有无匹配，从而证明此序列确实来源于基因组。用本实验室开放阅读框架寻找工具查找基因序列可能的编码框架。
结果
1.NotⅠ酶切BAC基因组DNA的脉冲场凝胶电泳
为了确定BAC克隆外源片段的大小，首先用Not Ⅰ内切酶酶解BAC407、BAC1840和BAC414克隆。经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定是否酶切完全。如图。可见Not Ⅰ酶解后，载体片段(7.1 Kb)完全释放出来，说明酶解完全。酶解样品再经冲场电泳分离确定每个BAC的大小。从图2可见，BAC407的外源片段约为50 Kb;BAC414的外源片段约为90 Kb；BAC1840的外源片段的为110 Kb。
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图1 琼脂糖凝胶电泳
(M:Marker,1:BAC407,2:BAC414,3:BAC1840)
图2 脉冲场凝胶电泳
(M:Marker,1:BAC407,2:BAC414,3:BAC1840)
2.Pst Ⅰ酶切BAC DNA的琼脂糖凝胶电泳
本实验的第一步为选择合适的限制性内切酶酶切BAC DNA。因为BAC DNA的酶解片段要与载体PSPL3相连接。为了保证连接效率，酶解片段不能太大；同时酶解片段也不应太小，从而使其可能包含的外显子的机率降低。所以合适的范围为2～6 Kb。实验中选择了载体多克隆位点上不同限制性内切酶PstⅠ，Eco RⅠ和BamHⅠ分别进行酶切。经过比较，PstⅠ内切酶的酶解片段较符合要求(如图3)，因此用它进行以下的实验。
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图3 Pst Ⅰ酶切BAC DNA的琼脂糖凝胶电泳
(M:Marker;1:BAC5G11;2:BAC222J22 3:BAC34P24;4:BAC586L11;5:BAC12506)
3.Pst Ⅰ酶切重组子克隆的琼脂糖凝胶电泳
BAC DNA酶解片段与载体连接，转化。为了验证连接效率，必须对重组子进行鉴定。挑取克隆，小量抽提后，用Pst Ⅰ内切酶酶切后电泳，观察有无外源片段的释放。如图4所示，每个克隆均有外源片段。
图4 重组子克隆Pst Ⅰ酶切后的琼脂糖凝胶电泳
4.总RNA的甲醛凝胶电泳
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将抽提的混合重组子DNA转染COS-7细胞，培养一定时间后，进行总RNA的抽提。如图5所示，表明RNA质量完好，没有降解。
图5 总RNA的甲醛凝胶电泳
1：BAC5G11；2：BAC222J22；3：BAC347P24；4：BAC586L11；5：BAC12506；6：control
5.逆转录多聚酶链反应后产物的鉴定
将总RNA先进行逆转录，再用试剂盒中特定的引物进行第一轮和第二轮PCR，走琼脂糖凝胶电泳，观察有无条带产生。如图6所示，表明可能有外显子片段。
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图6 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
5G11-1的序列：
GAGGCTCAGA GGATGCCACC GAGTGGACGG ACGTGAGCAG GACCACAGAG ACAACCCAGT
GGGACACGCA ACACTGTTCC CAAGATGTTA GCAGGGGAAA GAGTCGGACG AAATGGCGAA
GTGTTTGGCA CAAAGAAGAC CAACAAATGA CACACCAAGC CAGTAAAGAC ACCTCCAC
6.候选阳性外显子克隆的测序结果
将含有外显子片段的克隆培养，抽提质粒DNA，定量后用377型自动测序仪测序。本文列出5G11-1的序列的序列。其它序列不再赘述。
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7.候选阳性外显子克隆序列的计算机分析结果
将所得序列与计算机里的序列数据库进行比较
附表 外显子克隆序列的计算机分析结果 BAC克隆
外显
子数
外显子性质
BAC407I21：
4
肌球蛋白外显子；磷脂酰肌醇激酶外显子，新基因外显子，空载体
BAC5G11：
3
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新基因外显子，载体来源，空载体
BAC347P24：
2
新基因外显子，载体来源
BAC222J22：
2
Tau基因外显子，载体来源
BAC12506：
2
OVCA1基因外子，载体来源
BAC586L11：
1
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载体来源
3 讨论
外显子捕获法(Exon Trapping)的原理是根据前体mRNA在转录后发生内含子剪切而设计[2]。把一段基因组序列克隆入合适的载体中。该载体含有发生剪切序列所必须的剪切信号。若这段基因组序列含有完整的外显子，在转录后就能发生剪切。该方法已被多家实验室采用，已生产出专用的试剂盒，使用较为方便。文献报道，此方法的灵敏度为20～80 kb范围内可以捕获一个外显子[4]。本实验总共获取8个外显子片段，而原始BAC克隆覆盖的杂合性缺失范围约为450 kb，因此灵敏度与报道相符。获取的8个外显子片段(代表7个外显子)中有6个与17p数据库有高度匹配，说明它们确实来自缺失区域内。而BAC222J22的Tau基因的外显子片段经证实不在17p内。原因可能是此BAC克隆为嵌合克隆，其基因组片段由两部分组成。
从结果可看出，有相当一部分为同一载体为源的假阳性外显子(在挑选克隆测序的过程中，已经剔除了大部分认为可能是同一外显子的克隆，其根据是它们的PCR产物电泳时处于同一位置。当然PCR产物处于同一位置的克隆其外显子也有可能不一样，对此，作者也挑选进行测序。然而结果是全部来源于载体的同一序列)。由此推测，在整个转化所得的克隆中，载体来源的假阳性外显子比例将达70 %～80 %。假阳性率太高，不能令人满意。经仔细研究了载体的序列后，发现在HIV-TAT的内含子中，多克隆位点的右侧，有一隐蔽剪切位点(包括受体和供体)，长度约为110bp，它可以发生类似外源外显子的剪切，逃避BstXⅠ的降解作用，强烈地干扰正常的捕获过程，使假阳性率大大提高[4]。另外有一些克隆测不出序列，显示为混合克隆。原因可能是挑取培养的过程中，操作失误，导致克隆的相互污染，然而检查其PCR产物却只有一条带，说明污染的可能性不大；也可能此克隆在扩增的过程中发生突变，导致序列的不一致。空载体产生的原因则是BstⅪ酶切处理不完全。
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作者简介：郭鸣雷，男，硕士，实习研究员。
参考文献
[1]Saxena A,Clark WC,Stark M,et al.Evidence for the involvement of a potential second tumor suppressors on chromosome 17 distinct from p53 in malignant astrocytomas〔J〕.Cancer Res,1992,52:6716
[2]卢大儒,邱信芳,薛京伦.医学分子遗传学〔M〕.上海：复旦大学出版社，1997：69
[3]Church DM,Stoler CJ,Jones D,et al.Isolation of genes from complex sources of mammalian genomic DNA using exon amplification〔J〕.Nature Genet,1994:98:6
[4]Burn TC,Connors TD,Berd AP,et al.Increased exon-trapping efficiency through modifications to the PSPL3 splicing vector〔J〕.Gene,1995,161:183
(收稿日期：1999-10-14；修回日期：2000-01-17), 百拇医药